江苏大学学报（医学版）

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基础医学

KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定

马新廷，郝婷婷，朱小飞，卢春

2012, 22(1): 1.

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目的：制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirus，KSHV）编码的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）的多克隆抗体，通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定，并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测。方法：对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析，设计并合成3条多肽，将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联作为抗原，免疫新西兰白兔，制备抗vFLIP的多抗；以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段，插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中，构建pEF-vFLIP表达载体，利用脂质体将其转染HEK293T细胞，并在其中表达vFLIP。采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性，将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测。结果：经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP，Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白。进一步的ELISA结果显示，制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1∶11 000以上。该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应，而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白。结论：构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体；采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗，可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白。

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基础医学

H:z66抗体应激后伤寒沙门菌fliG基因缺陷株与野生株基因表达的差异

张晓磊，生秀梅，张海方，徐顺高，黄新祥

2012, 22(1): 9.

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目的：观察伤寒沙门菌鞭毛转子蛋白基因fliG在H:z66抗体应激后对其他基因表达的影响。方法：利用自杀质粒介导的同源重组法制备伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株；利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后的基因表达谱差异，并选择部分表达有差异的基因进行实时定量PCR验证。结果：经PCR验证及序列比对，伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株制备成功；基因表达谱比较结果表明，与野生株相比，伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后有21个基因表达上调，7个基因表达下调；实时定量PCR结果与芯片结果一致。结论： fliG基因在伤寒沙门菌受到H:z66抗体刺激后的基因表达调控中发挥一定作用。

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基础医学

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

郝婷婷，马新廷，朱小飞，卢春

2012, 22(1): 14.

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目的：构建含有人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I，HIV-1）负性调节因子（negative regulation factor，Nef）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的重组融合蛋白分泌性表达载体，并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况，为进一步研究Nef功能奠定基础。方法：利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因，插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒，转染293T细胞，荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液，蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果：限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实，成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体，该质粒转染293T细胞后，蛋白质印迹法能够检测到NefEGFP融合蛋白的表达条带，ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论：成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒，融合蛋白NefEGFP在293T细胞中获得表达，并能分泌到胞外。

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基础医学

无血清培养联合多柔比星诱导A549细胞耐药

秦蓉，许文林，惠璐璐，朱小兰，龙露露，陈巧云，曹渊

2012, 22(1): 19.

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目的：探索快速建立肺癌耐药细胞模型的新方法，并探讨肺癌耐药和干细胞的相关性。方法：应用无血清培养联合药物筛选法建立肺腺癌细胞耐药株A549/ADM；MTT法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、ABCB1和ABCG2的表达水平及细胞内多柔比星的浓度；细胞免疫荧光及流式细胞仪通过特异性表面抗原标记法（CD133）检测肿瘤干细胞含量。裸鼠皮下种植瘤试验评估A549/ADM的致瘤性。结果： A549细胞经无血清培养可见细胞球形成；A549/ADM细胞对多柔比星、长春新碱、紫杉醇均产生了耐药，其耐药指数分别为A549的13.167，12.86，3.4倍；与亲代A549相比，耐药株A549/ADM S期细胞比例由(45.76±1.41)% 降低至(23.33±1.32)%,细胞凋亡百分率由(58.23±0.82)% 减少至(16.49±0.77)%；耐药株A549/ADM中ABCB1和ABCG2的表达水平明显增高(P<0.05)，且细胞内多柔比星浓度明显低于A549细胞； CD133细胞在A549/ADM和A549中的比例分别为(6.2±0.7)％和(1.9±0.2)％(P<0.05)，免疫荧光检测A549/ADM细胞CD133表达水平较A549细胞高；A549/ADM具有高致瘤性。结论：无血清培养联合多柔比星诱导能高效富集肺癌干细胞，成功建立了人肺腺癌A549/ADM多药耐药细胞模型。

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基础医学

来氟米特对类风湿关节炎患者Th17细胞免疫调节的影响

郑东海1，李晶1，吴玲1，尤海燕2

2012, 22(1): 24.

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目的：探讨来氟米特活性代谢产物A771726对类风湿关节炎（RA）患者外周血Th17细胞的影响及意义。方法：取RA患者外周血单个核细胞（PBMC），采用免疫磁珠法阴选出CD4⁺T辅助细胞（helper T cell, Th），将CD4⁺T细胞分别与不同剂量的A771726（15、30、60 μg/ml）和地塞米松（10^-6、10^-7、10^-8mol/L）共培养48 h，流式细胞术（FCM）检测RA患者外周血Th17/Th百分比；应用实时荧光定量逆转录聚合酶链技术(即RT-PCR)检测IL-17、ROR-γt mRNA水平。结果：在体外，来氟米特对RA患者外周血CD4⁺ T细胞胞内IL-17、ROR-γt mRNA 表达无明显抑制作用，地塞米松可以使CD4⁺ T细胞胞内IL-17、ROR-γt mRNA 表达明显减少，随着药物浓度的增加抑制作用更加明显。来氟米特对Th17/Th无明显影响，地塞米松能降低Th17/Th细胞百分比。结论：来氟米特对RA患者外周血Th17细胞无明显影响作用，而地塞米松则可显著降低Th17细胞在Th细胞中的比例。

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基础医学

胶质瘤U251细胞中CD133表达及干细胞特性分析

杨伟现1，欧阳琦2，周月鹏2，王存祖1，张志坚2，向定朝1，许慧中1，陆晓峰1

2012, 22(1): 27.

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目的：探讨CD133⁺细胞的生物学特性，分析CD133作为胶质瘤干细胞标记的可行性。方法：利用免疫荧光染色检测U251细胞中CD133、巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶( NSE )、神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等蛋白表达，分析CD133⁺细胞与CD133^－细胞中巢蛋白、NSE、GFAP阳性细胞存在的差异。结果： U251中CD133⁺细胞比例为0.060±0.003，在CD133⁺细胞中，巢蛋白阳性细胞，NSE和GFAP阴性细胞比CD133^－中明显增多；在CD133^－细胞中，也存在巢蛋白阳性细胞，数目较CD133⁺中明显减少，相反巢蛋白阴性细胞，NSE和GFAP阳性细胞明显增多。结论：胶质瘤U251细胞存在CD133⁺细胞，在CD133阳性和阴性细胞中，均存在干细胞样细胞，但是在CD133⁺细胞中此类细胞更多。

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基础医学

神经生长因子在NCI-H466细胞中的表达及其生物学意义

樊玉龙1,2，袁志诚1，杨勇1，封云3，张志坚3，李巧玉1

2012, 22(1): 31.

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目的：探讨神经生长因子（nerve growth factor，NGF）在小细胞肺癌细胞株NCI-H466中的表达及肺癌脑转移的可能机制。方法：采用免疫荧光标记技术观察人小细胞肺癌NCI-H466细胞中NGF的亚细胞定位表达，并采用MTT试验及Transwell试验观察NGF对NCI-H466细胞增殖及侵袭能力的影响。结果： NGF在NCIH466细胞中亚细胞定位表达存在细胞周期特异性，在分裂间期，NGF主要呈颗粒状分布于细胞核内；在分裂中期，NGF分布于纺锤丝上。加入外源性NGF的NCI-H466细胞增殖明显加速，侵袭能力增强。结论： NGF可以促进NCI-H466细胞增殖和迁移，中枢神经系统内高NGF水平可能是肺癌易于发生脑转移的原因之一。NGF在肺癌细胞内具有亚细胞定位表达的特点，有可能作为一种新的治疗靶点。

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基础医学

基于hxgprt 缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建

吴亮，姜旭淦，李礼，鞠爱萍，沈进，傅行礼，陈盛霞，周红

2012, 22(1): 34.

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目的：构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）标记顶质体的弓形虫突变株，建立检测顶质体的简便方法。方法：扩增顶质体酰基载体蛋白（acyl carrier protein, ACP）基因并构建转染载体pHX-ACP-GFP，转入弓形虫hxgprt-株速殖子，经霉酚酸和黄嘌呤筛选荧光突变株。激光共聚焦显微镜和蛋白质印迹技术检测突变株ACP-GFP融合蛋白的表达。结果：通过霉酚酸和黄嘌呤筛选，可以在1周内获得突变株。激光共聚焦显微镜下观察到ACP-GFP融合蛋白聚集于顶质体，用抗GFP抗体能检测出ACP的转运肽型和成熟型蛋白。结论：顶质体荧光突变株可清晰标记出顶质体的位置，借助GFP标签即可检测融合蛋白的表达。

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基础医学

嗅鞘细胞上清液对抗过氧化氢诱导的星形胶质细胞损伤的线粒体机制

邱晶1，高静1，熊御云2，刘锦波3

2012, 22(1): 38.

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目的：研究嗅鞘细胞上清液（olfactory ensheathing cell conditioned medium, OECCM）对星形胶质细胞的保护作用及其线粒体机制。方法：先用500 μmol/L H₂O₂损伤星形胶质细胞20 min；再以50%的OECCM继续培养细胞24 h。MTT法检测星形胶质细胞的活性，Hoechst 33342 染色法和蛋白质印迹法检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspase-3的表达；用JC-1染色法检测线粒体的膜电位。结果： OECCM能减少H₂O₂诱导的细胞凋亡，减少caspase-3的表达，并且使线粒体膜电位增高。结论： OECCM可以对抗500 μmol/L H₂O₂诱导的星形胶质细胞凋亡，其机制可能与稳定线粒体膜电位有关。

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基础医学

慢性粒细胞白血病患者HAGE基因启动子的低甲基化

陈芹1，钱军1，王翠竹1，柴海彦1，杨静1，李云1，林江2，姚冬明1，马吉春2，陈星星1

2012, 22(1): 43.

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目的：探讨中国人群慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者螺旋酶抗原(helicase antigen,HAGE)基因启动子的甲基化状况和临床相关性。方法：应用甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR，MSP）技术对50例不同临床分期的CML患者骨髓标本HAGE基因启动子的甲基化状态进行检测。结果： 13例（26%）CML患者存在HAGE基因启动子的低甲基化改变，而24例对照均无HAGE基因低甲基化，两组比较差异有统计学意义（P=0.007)。HAGE基因启动子低甲基化改变与CML患者的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、临床分期及染色体异常均无相关性（P>0.05）。慢性期、加速期和急变期患者中HAGE基因启动子低甲基化频率分别为25%（9/36）、25%（1/4）和30%（3/10）（P>0.05）。结论： HAGE基因启动子低甲基化是CML中的常见分子事件。

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基础医学

转化生长因子-β1在多柔比星致大鼠心肌细胞凋亡中的促进作用

陈星，潘建业，周艳芳，王好，顾琳，张国辉

2012, 22(1): 46.

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目的：探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在多柔比星诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法：取出生1～2 d的SD大鼠心肌细胞进行体外分离及纯化，用α-横纹肌肌动蛋白（α-SA）免疫化学染色法鉴定细胞纯度。将培养第3天的心肌细胞随机分为对照组和不同浓度（0.5，1，2 μmol/L）多柔比星处理组，同时对各浓度组的不同时间点（4，12，24，48，72 h）进行检测。用MTT法检测心肌细胞存活率，流式细胞术Annexin Ⅴ/PI双染法检测心肌细胞凋亡率，ELISA法检测心肌细胞上清TGFβ1蛋白浓度。结果：原代分离培养第3天的心肌细胞纯度可达90%。多柔比星在0.5～2 μmol/L浓度范围内，随着处理时间延长，心肌细胞存活率下降，呈剂量和时间依赖性；2 μmol/L多柔比星可诱导心肌细胞凋亡，在4～48 h内细胞凋亡率不断增加，且心肌细胞TGF-β1蛋白表达量也逐渐增加，与凋亡率呈正相关。结论： TGF-β1可能在多柔比星诱导的大鼠心肌细胞凋亡中起促进作用。

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基础医学

急性胰腺炎患者外周血单个核细胞p38 MAPK信号通路的变化

李桂芬1，郭继强2

2012, 22(1): 51.

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目的：探讨急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）信号水平的变化及其与疾病严重程度的关系。方法：收集轻型胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）组29例及重症胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）组23例, 健康对照组21例。荧光实时定量PCR检测患者PBMC p38 MAPK基因表达水平，蛋白质印迹法检测PBMC p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK（P-p38 MAPK）的水平。统计处理用单因素方差分析（One-Way Anova）和LSD法。结果： p38 MAPK基因表达水平，SAP组较对照组升高了11.7%（P＜0.05），但MAP组与对照组比较差异无统计学意义；p38 MAPK总蛋白量SAP组较对照组增加了18.7% （P＜0.05），但MAP组与对照组相比较差异无统计学意义；磷酸化p38 MAPK水平SAP 组较对照组和MAP组分别提高了444.4%（P＜0.01）和44.1%（P＜0.05），MAP组较对照组增加了27.8%（P＜0.05）。结论： p38 MAPK磷酸化水平在AP患者PBMC中显著升高，并与AP严重程度呈正相关；AP患者PBMC p38 MAPK基因表达水平和蛋白水平变化较小。

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基础医学

大黄酸对高脂血症小鼠肝脏脂肪含量的影响

吕鹏1,2，盛宏光2

2012, 22(1): 55.

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目的：观察大黄酸对高脂诱导的高脂血症小鼠肝脏脂肪含量调节作用。方法：以高脂肪饮食诱导制作小鼠高脂血症模型，高脂血症模型随机分为大黄酸组（6只）、模型组（6只），同龄C57BL/6正常小鼠为对照组（6只）。治疗8周后，观察各组的体质量增长率，摄食量，肝脏脂肪含量，血清谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST）和血肌酐（SCr）。结果：模型组和大黄酸组的进食量较对照组低（P<0.01），而大黄酸组的进食量与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。实验结束时，对照组、模型组和大黄酸组的体质量平均增长率分别为1.79%，10.69%，6.23%，大黄酸组体质量平均增长率较模型组明显降低（P<0.01）。对照组、模型组和大黄酸组的肝脏脂肪含量分别为2.71%，16.49%，8.36%，大黄酸组的肝脏脂肪含量较模型组明显降低（P<0.01）。3组治疗后的AST，ALT和SCr水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：大黄酸有抑制脂肪在肝脏沉积的作用，且不良反应小。

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基础医学

米屈肼预给药对小鼠急性肺损伤的保护作用

葛家希，邵东华，王洪

2012, 22(1): 58.

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目的：研究米屈肼对脂多糖所致小鼠急性肺损伤的保护作用。方法：雄性ICR小鼠72只，随机分为正常对照组、急性肺损伤模型组、米屈肼预处理组。米屈肼组连续6天经腹腔注射米屈肼（100 mg/kg），正常对照组和模型组均以等量生理盐水代替米屈肼。模型组和米屈肼组以脂多糖（4 mg/kg）经气管内滴入，正常对照组经气管内滴入等量生理盐水，6、12、24 h后处死小鼠，收集小鼠肺组织，测定各组肺湿重/干重比值、肺组织匀浆丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活力及中性粒细胞髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量。结果：米屈肼组炎症浸润和出血渗出均较模型组减轻，肺湿重/干重比值（W/D）及肺组织中丙二醛、MPO含量均较模型组明显降低（P<0.05），肺组织总SOD活力则明显升高（P<0.05）。结论：米屈肼预处理对脂多糖所致急性肺损伤具有保护作用。

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临床医学

不同年龄错畸形患者和个别正常学生患者EPQ测量结果的比较

佘鹏1，孔繁芝1，经海永2，钱良玉1，储婷1，周红3

2012, 22(1): 63.

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目的：探讨镇江市错畸形学生患者的心理，为临床工作提供指导。方法：根据学校综合实力的不同，采用随机分层整群抽样的方法，随机抽取镇江市9所学校不同年级38个班的1 430名学生，根据纳入和排除标准筛选出符合标准的404名个别正常学生；随机选取医院口腔正畸门诊就诊的学生正畸患者367名，并根据年龄分为少年（12～15岁）组和成人（16岁以上）组，然后在相同的环境条件和相同的指导语指导下进行艾森克个性问卷（EPQ）测量，计算测量结果。结果：少年患者在N分量表以及P分量表上的评分高于少年个别正常学生，在E分量表上的评分低于少年个别正常学生，以上差异均有统计学意义。其中的成人学生患者在P分量表、N分量表和L分量表上的评分高于成人个别正常学生，E分量表上的评分低于成人个别正常学生，差异均有统计学意义。结论：与个别正常学生比较，错畸形学生患者均表现为内向型人格倾向和不稳定型人格倾向，其中的成人错畸形学生患者还表现有精神质以及较高的掩饰性，临床治疗时应考虑到患者的心理因素。

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临床医学

心房颤动患者心型脂肪酸结合蛋白检测的临床价值

王怡练，孙黎明，王伟，滕士阶，徐海涛

2012, 22(1): 66.

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目的：评价定量检测血清心型脂肪酸结合蛋白(heart type-fatty acid binding protein，H-FABP)对心房颤动患者检测的临床价值。方法：采用酶联免疫吸附试验一步夹心法检测196名健康体检者、196例心房颤动患者的血清H-FABP，同时测定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶同工酶-MB (creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)，并作比较。结果：房颤组治疗前、治疗后及对照组的H-FABP值分别为（2.8±1.3）μg/L，（2.3±1.4）μg/L和（1.6±1.1）μg/L；cTnI值分别为（0.26±0.05）μg/L，（0.23±0.06）μg/L和（0.05±0.02）μg/L；CK-MB值分别为(12.8±3.6) U/L，(13.6±3.1)U/L和(12.1±2.7) U/L。血浆H-FABP水平房颤组治疗前、治疗后及与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；血浆cTnI水平在房颤治疗前、治疗后比较差异无统计学意义(P>0.05)，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；血浆CK-MB水平房颤组治疗前、治疗后及与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：检测血清H-FABP对心房颤动患者有较重要的临床价值。

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临床医学

复杂性输尿管上段结石的两种微创手术方法的疗效比较

毛卫江，莫乃新，吕忠，吴斌，史红雷，王旭刚

2012, 22(1): 69.

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目的：比较经皮肾镜取石术（percutaneous nephrolithotomy,PCNL）和后腹腔镜下输尿管切开取石术（retroperitoneal laparoscopic ureterolithotomy ,RLU）治疗复杂性输尿管上段结石的疗效。方法：回顾性分析71例复杂性输尿管上段结石患者临床资料，PCNL组31例和RLU组40例，对比两组病例手术时间、术后1周结石清除率、手术并发症。结果： 71例手术全部成功，手术时间PCNL组[（48.52±17.51 ）min]短于RLU组[（87.43±22.63）min]，差异有统计学意义(P<0.01)。术后1周结石清除率PCNL组为96.8%（30/31），RLU组100%（40/40），两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术中、术后均无明显出血及周围脏器损伤等并发症。术后随访3~10个月，平均7个月，两组均未发现结石复发及输尿管狭窄。结论： PCNL和RLU治疗复杂性输尿管上段结石均是安全、有效的方法。复杂性输尿管上段结石的治疗可视患者具体情况、单位设备条件、术者经验酌情选择PCNL或RLU。

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临床医学

血清白三烯B4水平与急性冠脉综合征发病风险和易患因素的相关性分析

叶姗1，何国平1，惠静姣1，沈丹丹1，戚传平2，许联红2

2012, 22(1): 73.

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目的：观察急性冠状动脉综合征（ACS）患者血清白三烯（leukotriene，LT）B4水平的变化及其与易患因素的相关性，探讨其在ACS中可能的临床意义。方法：采用酶联免疫吸附法测定403例ACS患者和132例非冠心病患者（对照组）血清LTB4水平。结果：血清LTB4水平在急性心肌梗死（AMI）组和不稳定型心绞痛（UAP）组分别为（477.97/370.52 pg/ml）和（352.52/255.48 pg/ml），显著高于对照组（200.57/236.65 pg/ml）（P<0.001）；且AMI组的血清LTB4水平显著高于UAP组（P<0.001）。ACS患者的血清LTB4与吸烟呈正相关（P<0.05），与男性、高龄、高血压、糖尿病、高血脂无关（P>0.05）。结论： ACS患者血清LTB4水平增高；LTB4水平与吸烟呈正相关。

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经验技术交流

VITEK 2 Compact高级专家系统对肠杆菌科及铜绿假单胞菌中β-内酰胺酶耐药表型鉴别能力分析

宋逸萍，宛传丹，马月琴，邹学军

2012, 22(1): 77.

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经验技术交流

经鼻双相正压通气治疗早产儿呼吸窘迫综合征的临床研究

杨娟，周婷，沙宁，侍响响

2012, 22(1): 80.

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综述

谷氨酰内切酶的催化特性研究与应用进展

李礼，姜旭淦

2012, 22(1): 83.

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综述

22MafA基因与糖尿病关系的研究进展

高羽，刘宝华，童卫东，张安平，李凡，王李

2012, 22(1): 86.

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综述

ω-3脂肪酸在心血管疾病防治中的作用研究进展

陈蕊，严金川

2012, 22(1): 90.

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